細(xì)胞毒性檢測(cè)是生物相容性測(cè)試的一種，檢測(cè)藥物或者新型材料在生物環(huán)境中的毒性情況，即通過(guò)檢測(cè)材料或者藥物對(duì)細(xì)胞的增殖或者生長(zhǎng)的影響，來(lái)評(píng)價(jià)藥物或材料的毒性或者活性，主要用于藥物活性篩選、細(xì)胞增殖/毒性測(cè)定、抗腫瘤藥效計(jì)算IC50等;常用MTT法或者CCK8法檢測(cè)，另外也可以通過(guò)Live/dead雙染法進(jìn)行細(xì)胞成像，更直觀的記錄細(xì)胞的存活情況。

　　細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理

　　1.CCK-8測(cè)試

　　CCK-8試劑(Cell Counting Kit-8 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑)中含有WST–8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽)，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物(Formazan)，生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。注：貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞均可使用此方法，懸浮細(xì)胞CCK-8孵育時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)。

　　2.MTT測(cè)試

　　活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原成水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能;二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的甲臢，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比，使用多功能酶標(biāo)儀在490nm處測(cè)定其吸光值，從而定量測(cè)定細(xì)胞的存活比例。

　　注：多用于貼壁細(xì)胞。

　　3、Live/Dead細(xì)胞染色

　　活/死細(xì)胞雙染試劑盒可同時(shí)對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行熒光染色。該試劑盒包含鈣黃綠素-AM和碘化丙啶(PI)兩種溶液，分別用于染色活細(xì)胞和死細(xì)胞。其中鈣黃綠素-AM，即鈣黃綠素的乙酰羥甲基酯，具有高度親脂性和細(xì)胞膜透過(guò)性。盡管鈣黃綠素-AM自身并非熒光分子，但活細(xì)胞中的酯酶可以催化鈣黃綠素-AM生成鈣黃綠素，從而發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光(λex 490 nm, λem 515 nm). 因此鈣黃綠素-AM只能染色活細(xì)胞。而核染色染料PI不能透過(guò)活細(xì)胞的細(xì)胞膜。但可以透過(guò)死細(xì)胞膜的變性區(qū)域來(lái)到達(dá)細(xì)胞核，并與細(xì)胞中的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而發(fā)出紅色熒光(λex 535 nm, λem 617 nm)。鈣黃綠素和PI-DNA都能被490nm波長(zhǎng)的光激發(fā)，因此可以采用熒光顯微鏡同時(shí)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞和死細(xì)胞。使用λex激發(fā)光時(shí)只能觀察到死亡細(xì)胞。