雙縮脲法(Biuret method)是測定蛋白質(zhì)含量的一種經(jīng)典方法，它的原理是基于蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下與銅離子形成紫紅色絡(luò)合物的特性。這種方法簡單、快速，但是靈敏度相對較低，適用于蛋白質(zhì)濃度較高的樣品。下面是雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量的基本實驗步驟：

　　實驗材料和試劑

　　標準蛋白質(zhì)溶液：通常使用牛血清白蛋白(BSA)作為標準蛋白質(zhì)，配制成已知濃度的溶液。

　　雙縮脲試劑：由硫酸銅、酒石酸鉀鈉和氫氧化鈉組成，配制成藍色透明溶液。

　　吸光光度計：用于測定溶液在特定波長下的吸光度。

　　蒸餾水：用于配制標準蛋白質(zhì)溶液和清洗實驗器具。

　　實驗步驟

　　標準曲線的繪制：

　　準備一系列不同濃度的標準蛋白質(zhì)溶液，例如0mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL。

　　分別取1mL上述標準蛋白質(zhì)溶液于數(shù)個試管中，每管加入4mL雙縮脲試劑，混勻。

　　讓試管在室溫下(約20-25°C)靜置30分鐘，使反應(yīng)完全。

　　使用吸光光度計在540nm波長下測定每個試管的吸光度。

　　以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

　　樣品測定：

　　準備待測樣品，如果樣品濃度未知，可以先進行預(yù)估或稀釋。

　　取1mL樣品于試管中，加入4mL雙縮脲試劑，混勻。

　　同樣地，在室溫下靜置30分鐘后，測定樣品在540nm下的吸光度。

　　數(shù)據(jù)處理：

　　根據(jù)樣品的吸光度值，在標準曲線上找到對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度。

　　如果樣品進行了稀釋，記得將得到的濃度乘以稀釋倍數(shù)，以得到原始樣品的實際蛋白質(zhì)濃度。

　　注意事項

　　確保所有樣品和標準品的處理條件一致，以避免系統(tǒng)誤差。

　　測定吸光度時，使用蒸餾水作為空白對照，以校正儀器零點。

　　反應(yīng)完成后應(yīng)盡快測定吸光度，以避免絡(luò)合物分解導致讀數(shù)不準確。

　　每次實驗應(yīng)重復測定，以增加數(shù)據(jù)的可靠性。

　　通過雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量，可以得到較為粗略但快速的結(jié)果，適用于初步篩選或大樣本量的蛋白質(zhì)濃度測定。對于更精確的測定，可能需要采用靈敏度更高的方法，如BCA法或Bradford法。