膠原纖維異常沉積是纖維化疾病、腫瘤微環(huán)境重塑及創(chuàng)傷修復(fù)的關(guān)鍵病理標志。Masson三色染色法通過差異化染色肌肉、膠原及紅細胞，為組織纖維化評估提供直觀依據(jù)。然而，傳統(tǒng)石蠟切片Masson染色流程復(fù)雜、周期長，而冰凍切片Masson染色技術(shù)憑借快速、保留抗原性等優(yōu)勢，成為術(shù)中快速診斷與前沿研究的s選方案。本文系統(tǒng)闡述冰凍切片Masson染色的技術(shù)難點、優(yōu)化策略及多場景應(yīng)用，為臨床與科研提供標準化解決方案。

　　一、技術(shù)原理與染色機制

　　1. Masson染色化學(xué)基礎(chǔ)

　　Masson三色法通過階梯式染色區(qū)分組織成分：

　　細胞核：蘇木精(藍色)與鋁離子絡(luò)合，結(jié)合DNA雙螺旋;

　　肌肉/紅細胞：麗春紅-酸性品紅復(fù)合染液(紅色)靶向嗜酸性結(jié)構(gòu);

　　膠原纖維：苯胺藍或亮綠(藍色/綠色)選擇性結(jié)合堿性氨基酸殘基。

　　2. 冰凍切片的獨特挑戰(zhàn)

　　形態(tài)學(xué)缺陷：冰晶形成導(dǎo)致組織裂隙;

　　染色不均：未固定組織易脫片，染色液滲透性差;

　　對比度低：膠原與肌肉區(qū)分度不足。

　　二、冰凍切片Masson染色標準化流程

　　1. 樣本制備關(guān)鍵步驟

　　Step 1 組織處理與速凍

　　取材規(guī)范：新鮮組織≤0.5 cm3，避免擠壓;

　　速凍方案：OCT包埋后液氮驟冷(-160℃，10秒)或異戊烷-干冰浴(-80℃，2分鐘);

　　儲存條件：-80℃密封保存，避免凍融循環(huán)。

　　Step 2 切片與貼附

　　切片厚度：5~8 μm(Leica CM1950恒溫切片機，腔室溫度-20℃);

　　防脫片處理：APES或多聚賴氨酸載玻片預(yù)處理，37℃烘片2小時。

　　Step 3 快速固定與染色優(yōu)化

　　固定液選擇：預(yù)冷丙酮(-20℃)固定10分鐘，保留抗原性;

　　染色流程(改良版)：

　　2. 成像與判讀標準

　　顯微鏡配置：

　　正置光學(xué)顯微鏡(10×~40×物鏡)，偏振光模塊增強膠原雙折射信號;

　　全玻片掃描儀(20×，數(shù)字化存檔)。

　　定量分析：

　　膠原面積比：Image-Pro Plus軟件閾值分割，計算膠原占比(%);

　　纖維走向分析：Fast Fourier Transform(FFT)評估纖維各向異性。

　　三、技術(shù)難點與質(zhì)控體系

　　1. 常見問題與解決方案

　　2. 質(zhì)控標準與驗證方法

　　陽性對照：正常肝組織(匯管區(qū)膠原)或皮膚真皮層;

　　重復(fù)性要求：同一批次染色CV<8%，不同操作員間CV<12%;

　　準確性驗證：與天狼星紅偏振光染色結(jié)果高度一致(R2>0.90)。

　　四、應(yīng)用場景與典型案例

　　1. 臨床病理快速診斷

　　甲狀腺術(shù)中冰凍：鑒別濾泡癌與腺瘤，膠原包膜浸潤評估(靈敏度92%，特異性88%);

　　肝穿刺活檢：非酒精性脂肪性肝炎(NASH)纖維化分期(Metavir評分)。

　　2. 纖維化疾病機制研究

　　肺纖維化模型：博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺膠原沉積動態(tài)監(jiān)測(第7/14/21天染色對比);

　　技術(shù)延伸：Masson染色聯(lián)合α-SMA免疫熒光，定位肌成纖維細胞活化區(qū)域。

　　3. 腫瘤微環(huán)境解析

　　乳腺癌基質(zhì)反應(yīng)：腫瘤相關(guān)成纖維細胞(CAFs)介導(dǎo)的膠原重塑分析;

　　量化指標：膠原排列方向與患者預(yù)后顯著相關(guān)(HR=1.45，p=0.003)。