方法 1：spike-in(外源內(nèi)標法)

　　推薦方法

　　原理：

　　在提取DNA前，向已知質(zhì)量的環(huán)境樣品中加入已知數(shù)量的外源微生物或合成DNA片段(spike-in)，作為“分子標尺”。

　　測序后，通過比較spike-in 的測序讀數(shù)與實際添加量，建立“測序數(shù)據(jù) → 實際數(shù)量”的換算關(guān)系，進而推算樣品中所有微生物的絕對豐度。

　　常用 spike-in 材料：

　　操作流程：

　　稱取一定質(zhì)量樣品(如0.1 g土壤);

　　加入已知拷貝數(shù)的spike-in(如10? copies);

　　同時進行DNA提取、建庫、測序;

　　測序后，統(tǒng)計spike-in的reads數(shù)(如10,000 reads);

　　計算“每read對應(yīng)的實際拷貝數(shù)”：

　　應(yīng)用于所有物種：

　　優(yōu)點：

　　精度高

　　可校正DNA提取、PCR擴增等技術(shù)偏差

　　適用于各種樣本(糞便、土壤、水體等)

　　缺點：

　　成本增加(需購買spike-in)

　　需精確稱樣和加樣

　　方法 2：基于16S rRNA基因拷貝數(shù)校正(間接法)

　　原理：

　　利用已知物種的16S rRNA基因拷貝數(shù)數(shù)據(jù)庫(如rrnDB);

　　將宏基因組中檢測到的16S序列豐度 × 拷貝數(shù)校正因子 → 推算細胞數(shù)量;

　　再結(jié)合總微生物量估算(如qPCR測16S總拷貝數(shù))→ 實現(xiàn)絕對定量。

　　流程：

　　用qPCR測定樣品中16S rRNA基因總拷貝數(shù)/g;

　　宏基因組分析得到各物種的相對豐度;

　　結(jié)合物種特異性16S拷貝數(shù)，計算各物種的絕對豐度。

　　優(yōu)點：

　　成本較低(無需spike-in)

　　適用于已有qPCR數(shù)據(jù)的研究

　　缺點：

　　依賴數(shù)據(jù)庫準確性

　　無法區(qū)分活/死細胞

　　對低豐度物種誤差大

　　方法 3：宏基因組+流式細胞術(shù)(FACS)聯(lián)合法

　　原理：

　　用流式細胞術(shù)直接計數(shù)樣品中總微生物細胞數(shù)/mL;

　　宏基因組提供物種組成;

　　兩者結(jié)合 → 各物種的絕對數(shù)量。

　　適用：

　　液體樣本(如海水、血液、發(fā)酵液)

　　限制：

　　固體樣本(如土壤、糞便)需有效分散成單細胞懸液

　　部分微生物難以染色或檢測

　　方法 4：宏基因組+數(shù)字PCR(dPCR)

　　用dPCR精確定量關(guān)鍵物種或總基因拷貝數(shù);

　　作為標尺，校正宏基因組數(shù)據(jù);

　　適合靶向絕對定量。